將待測DNA片段轉變成一系列放射性核素標記的單鏈寡核苷酸，并使其一端為一固定的末端。另一端由于長度不同，成為一系列相差一個堿基的連續末端。在分別含有4種脫氧核酸的反應體系中，寡核苷酸分別終止于不同位置的A、T、G或C堿基。將4種反應體系的寡核苷酸產物，在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中上樣于相鄰的加樣孔進行電泳分離。由于全部可能產生的不同大小寡聚核苷酸都存在于4種反應產物中，從放射自顯影后的4種末端寡聚核苷酸梯子形圖譜中，就可以直接讀出DNA序列。
DNA測序技術使直接檢測核苷酸突變成為可能，而不僅僅是基因片段的多態性分析，使臨床基因診斷更加精確。常用于探針設計、特異引物合成、基因結構分析等，在遺傳病診斷、微生物種屬鑒定、腫瘤診斷等領域廣泛應用，人類基因組計劃就是由于大規模自動化測序技術的發展而順利完成的。但由于DNA測序方法復雜，一般臨床實驗室無法進行，有必要時可委托有條件的公司或研究機構進行。
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